在完成工程竣工验收和初期运营前安全评估的基础上，经南京市政府批准，5号线南段将于2024年3月31日中午12时开通初期运营。届时，南京地铁运营里程将由12条线路近460公里增加至13条线路近473公里，车站总数由217座增加至226座。
5号线南段初期运营线路始于吉印大道站，于吉印大道与苏源大道交叉口处设九龙湖南站，于双龙大道与诚信大道交叉口东侧设诚信大道站，于诚信大道与殷富街交叉口处设前庄站，于科宁路与竹山南路交叉口处设科宁路站，于竹山路与天元东路交叉口处设竹山路站，于竹山路与新亭路交叉口处设新亭路站，于竹山路与上元大街交叉口处设东山站，于土山路与文靖路交叉口南侧设文靖路站。
5号线南段初期运营里程为12.9km，设车站9座。其中换乘站3座，分别在吉印大道站与既有S1号线换乘，在诚信大道站与既有3号线换乘，在竹山路站与既有1号线换乘（出站换乘）。全线均采用地下敷设方式。车辆采用A型车，6辆编组，列车最高运行速度为80km/h。
